Northern-Blot

Northern-Blot
schematischer Aufbau eines Northern Blot

Der Northern Blot ist eine molekularbiologische Methode zur Übertragung (Blotten) der in der Gelelektrophorese aufgetrennten RNA auf eine Membran (Diazobenzyloxymethyl-(DBM)-Papier oder unter bestimmten Bedingungen Nitrocellulose oder Nylon). Auf der Membran ist die spezifische Markierung von RNA-Sequenzen durch die Hybridisierung mit komplementären Gensonden möglich.

Der Name Northern Blot geht zurück auf die von Edwin Southern entwickelte Southern-Blot-Methode, in der DNA statt RNA geblottet wird. Der Name ist eine Allusion, da die Himmelsrichtungen nichts mit dem Verfahren zu tun haben. Die Northern Blot Methode wurde von J.C. Alwine et al.[1] für Diazobenzyloxymethyl-(DBM)-Papier eingeführt, und von P.S. Thomas[2] wie im einfacheren Southern Blot auf Nitrocellulose umgestellt.

Anwendung

Die Methode des Northern Blotting wird zum Beispiel verwendet, um die für ein Protein kodierende mRNA eines mutierten Organismus mit der eines "normalen" Organismus zu vergleichen. Ein entsprechender Versuch könnte folgendermaßen aussehen:

Man nimmt Gewebeproben, in denen das Protein vorkommt, bzw. vorkommen müsste, sowohl vom Mutanten, als auch vom normalen Individuum (als Kontrolle) und schließt die Zellen in einer an Detergens hoch konzentrierten Lösung auf, die die Nucleasen inaktiviert, damit diese die Nukleinsäuren nicht angreifen können. Nachdem die überflüssigen Proteine komplett denaturiert, durch wiederholte Phenolextraktionen stark abgereichert sowie auch kleinere Moleküle durch Fällung in Alkohol entfernt wurden, werden RNA und DNA durch ihre unterschiedlichen Löslichkeiten in Alkohol voneinander getrennt. Verunreinigungen von DNA können nun z.B. durch das hochspezifische Enzym DNase abgebaut werden. mRNAs werden durch Zurückhalten an einer chromatographischen Säule, die spezifisch die Poly(A)-Schwänze der mRNAs bindet, entfernt. Jetzt werden zunächst die intakten und gereinigten mRNA-Moleküle aus mutierten und aus normalem Gewebe durch Gelelektrophorese getrennt. Damit die RNA-Moleküle für DNA-Sonden zugänglich werden, überträgt (blottet) man das Bandenmuster der fraktionierten mRNA auf ein Blatt Nitrocellulosepapier. Diese Membran inkubiert man in einer Lösung die eine markierte DNA-Sonde enthält, deren Sequenz einem Abschnitt des Protein-Gens bzw. der mRNA entspricht. Die RNA-Moleküle, die auf der Membran mit der markierten Sonde hybridisieren, werden nun autoradiographisch oder chemisch nachgewiesen. Die Größe der RNA-Moleküle in jeder Bande kann durch Vergleich mit RNA-Molekülen bekannter Größe (RNA-Standards), die man parallel zu den experimentellen Proben laufen lässt, bestimmt werden. Nun kann man erkennen, ob und inwiefern sich die für das Protein kodierende mRNA des Mutanten von der des normalen Individuums unterscheidet.

Literatur

  1. ↑ Alwine J.C., Kemp D.J., Stark G.R. (1977): Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Bd. 74, S. 5350-5354. PMID 414220
  2. ↑ Thomas, P.S. (1980): Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Bd. 77, S. 5201-5205. PMID 6159641

Siehe auch


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