Nilblau

Strukturformel
Allgemeines
Name	Nilblau
Andere Namen	5-Amino-9-(diethylamino) benzo[a]phenoxazin-7-ium C.I. 51180 Basic Blue 12
Summenformel	C20H20N3O+
CAS-Nummer	2381-85-3 (Hydrochlorid) 3625-57-8 (Hydrogensulfat) 53340-16-2 (Perchlorat)
Kurzbeschreibung	dunkelgrüner Feststoff (Chlorid)[1] dunkelgrünes bis blau oder schwarzes Pulver (Sulfat)[1]
Eigenschaften
Molare Masse	318,39 g·mol−1
Aggregatzustand	fest
Schmelzpunkt	>300 °C[2]
Löslichkeit	löslich in Wasser (50 g·l−1 bei 25 °C)[2]
Sicherheitshinweise
GHS-Gefahrstoffkennzeichnung [3] Sulfat keine GHS-Piktogramme H- und P-Sätze H: keine H-Sätze EUH: keine EUH-Sätze P: keine P-Sätze EU-Gefahrstoffkennzeichnung [2] Reizend (Xi) R- und S-Sätze R: 36/38 S: 22
Soweit möglich und gebräuchlich, werden SI-Einheiten verwendet. Wenn nicht anders vermerkt, gelten die angegebenen Daten bei Standardbedingungen.

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Nilblau, oft auch als Nilblau A (meist nur das Hydrogensulfat) bezeichnet, ist ein fluoreszierender Phenoxazin-Farbstoff.

Als Indikatorfarbstoff zeigt Nilblau im saurem Milieu eine blaue Farbe und ist im Alkalischen rot.^[4]

Durch Kochen einer Lösung von Nilblau mit Schwefelsäure entsteht der Farbstoff Nilrot.

Eigenschaften

Nilblauhydrochlorid in Wasser in unterschiedlicher Konzentration.
V.l.n.r.: 1000 ppm, 100 ppm, 10 ppm, 1 ppm, 100 ppb.

Nilblau in Wasser bei verschiedenen pH-Werten.
V.l.n.r.: pH 0, pH 4, pH 7, pH 10, pH 14.

Nilblau in Wasser (untere Phase) und Ethylacetat (obere Phase) bei Tageslicht.
V.l.n.r.: pH 0, pH 4, pH 7, pH 10, pH 14

Nilblau in Wasser (untere Phase) und Ethylacetat (obere Phase) im UV-Licht (366 nm).
V.l.n.r.: pH 0, pH 4, pH 7, pH 10, pH 14

Nilblau (freie Base) bei Tageslicht (obere Reihe) und UV-Licht (366 nm, untere Reihe) in verschiedenen Lösungsmitteln.
V.l.n.r.: 1. Methanol, 2. Ethanol, 3. tert-Butylmethylether, 4. Cyclohexan, 5. n-Hexan, 6. Aceton, 7. Tetrahydrofuran, 8. Ethylacetat, 9. Dimethylformamid, 10. Acetonitril, 11. Toluol, 12. Chloroform

Nilblau ist ein Fluoreszenzfarbstoff. Die Fluoreszenz zeigt besonders in apolaren Lösungsmitteln eine hohe Quantenausbeute:^[5]

Die Absorption und Emissionsmaxima von Nilblau sind stark abhängig vom pH-Wert und dem verwendeten Lösungsmittel.

Die Absorptions- und Emissionsmaxima von Nilblau in Abhängigkeit vom verwendeten Lösungsmittel^[5]

Lösungsmittel	Absorption λmax (nm)	Emission λmax (nm)
Toluol	493	574
Aceton	499	596
Dimethylformamid	504	598
Chloroform	624	647
1-Butanol	627	664
2-Propanol	627	665
Ethanol	628	667
Methanol	626	668
Wasser	635	674
1,0 N Salzsäure (pH=1,0)	457	556
0,1 N Natronlauge (pH=11,0)	522	668
Ammoniakwasser (pH=13,0)	524	668

Die Fluoreszenzdauer von Nilblau wurde in Ethanol mit 1,42 ns bestimmt. Dies ist kürzer als der entsprechende Wert von Nilrot mit 3,65 ns. Die Fluoreszenzdauer ist relativ invariant gegenüber Verdünnungen im Bereich von 10⁻³ – 10⁻⁸ mol·dm⁻³.^[5]

Die Nilblau-Färbung

Nilblau wird zur histologischen Anfärbung von biologischen Präparaten verwendet. Dabei gelingt die Unterscheidung zwischen neutralen Lipiden (Triglyceride, Cholesterinester, Steroide) die rosa angefärbt werden und sauren (Fettsäuren, Chromolipide, Phospholipide) die blau angefärbt werden.^[6]

Die Nilblau-Färbung nach Kleeberg benötigt folgende Chemikalien

• Nilblau A
• 1%ige Essigsäure
• Glycerin bzw. Glyceringelatine

Der Arbeitsablauf

Das Präparat wird in Formol fixiert. Daraus werden Gefrierschnitte oder Zupfpräparate hergestellt. Anschließend wird für 20 Minuten in die Nilblau-Lösung getaucht und danach mit Wasser abgespült. Zur besseren Differenzierung wird in 1%ige Essigsäure für 10–20 Minuten eingetaucht, bis die Farbtöne rein sind. Dies kann u.U. schon nach 1–2 Minuten der Fall sein. Dann wird in mehrfach gewechseltem Wasser gründlich gewässert (ein bis zwei Stunden). Danach kann das angefärbte Präparat auf einen Objektträger gezogen und der Wasserüberschuss abgesaugt werden. Der Einschluss des Präparates kann in Glycerin oder lauwarmer Glyceringelatine erfolgen.

Das Ergebnis

Ungesättigte Glyceride sind rosa, Kerne und Elastica dunkelblau, Fettsäuren und zahlreiche Fettsubstanzen und Fettgemische blau bis violett gefärbt.^[7]

Beispiel: Nachweis von Poly-β-hydroxybutyrat-Granula (PHB)

Die PHB-Granula in den Zellen von Pseudomonas solanacearum können durch Anfärbung mit Nilblau A sichtbar gemacht werden. Die PHB-Granula der gefärbten Ausstriche zeigen unter einem Epifluoreszenzmikroskop bei 450 nm Anregungswellenlänge unter Ölimmersion, bei einer 1000 fachen Vergrößerung eine kräftige orangefarbene Fluoreszenz.^[8]

Nilblau in der Onkologie

Derivate des Nilblau sind potentielle Photosensibilisatoren in der Photodynamischen Therapie (PDT) von malignen Tumoren. Diese Farbstoffe werden durch Farbstoffaggregation in den Tumorzellen, speziell in den Lipidmembranen und/oder sequestriert in den subzellularen Organellen, stark angereichert.^[9]

Mit dem Nilblau-Derivat N-Ethyl-Nilblau (EtNBA) konnte in Tierversuchen zwischen normalem und prämalignem Gewebe mittels Fluoreszenzbildgebung beziehungsweise Fluoreszenzspektroskopie unterschieden werden. EtNBA zeigt dabei keine phototoxischen Effekte.^[10]

Einzelnachweise

1. ↑ ^{a b} Thieme Chemistry (Hrsg.): RÖMPP Online - Version 3.1. Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart 2008.
2. ↑ ^{a b c} Datenblatt Nilblau bei Merck, abgerufen am 3. Juni 2008.
3. ↑ Datenblatt Nile Blue A bei Sigma-Aldrich, abgerufen am 16. April 2011.
4. ↑ Universität Bochum, Ketogenese, Lipoproteine – biochemische Grundlagen, abgerufen am 27. Juni 2007.
5. ↑ ^{a b c} Jiney Jose and Kevin Burgess: Benzophenoxazine-based fluorescent dyes for labeling biomolecules, in Tetrahedron, 2006, 62, S. 11021–11037; doi:10.1016/j.tet.2006.08.056.
6. ↑ Roche Lexikon, abgerufen am 25. Juni 2007.
7. ↑ Benno Romeis, Mikroskopische Technik, 15. Aufl., R. Oldenbourg Verlag, München 1948.
8. ↑ 97/647/EG: Entscheidung der EU-Kommission vom 9. September 1997 über ein vorläufiges Versuchsprogramm für Diagnose, Nachweis und Identifizierung von Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in Kartoffeln, abgerufen am 27. Juni 2007.
9. ↑ C.W. Lin, J.R. Shulok, S.D. Kirley, L. Cincotta, J.W. Foley: Lysosomal localization and mechanism of uptake of Nile blue photosensitizers in tumor cells, in: Cancer Research, 1991, 51, S. 2710–2719; PMID 2021950.
10. ↑ H.J. van Staveren: Fluorescence imaging and spectroscopy of ethyl nile blue A in animal models of (pre)malignancies, in: Photochemistry and photobiology, 2001, 73, S. 32–38; PMID 11202363.

Literatur

• F.J. Green: The Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators, Aldrich Chemical Company, Milwaukee, 1990.
• J. Rao, A. Dragulescu-Andrasi, H. Yao: Fluorescence imaging in vivo: recent advances, in: Current Opinion in Biotechnology, 2007, 18, S. 17–25; PMID 17234399.